Introducción al RNA-Seq

9 de octubre de 2017

Leandro Roser

• Transcriptómica

  
  

• Conjunto total de transcriptos presentes en una célula, para un estadio específico del desarrollo o condición fisiológica

  
  

• Herramientas para el estudio del transcriptoma: tecnologías de alto rendimiento

  
  

• Microarrays
• Secuenciación masiva  (Next Generation Sequencing, NGS)

• Microarrays

  
  

• Extraer ARN de muestras


• Construir bibliotecas de ADNc marcadas con fluorocromos


• Poner en placa en igual proporción


• Se detecta el color emitido con una cámara

• Secuenciación masiva

  
  
• Diversas plataformas: (Roche 454, SOLiD, Illumina)
  
  
  

  Plataformas Illumina

  

• Secuenciación masiva

  
  

• Secuenciación - relación costo/Gb

  
  
  

  

• RNA-Seq (2008)

  
  
• 

  • Extraer ARN
  
  
  • Fragmentarlo
  
  
  • Construir biblioteca de ADNc
  
  
  • Secuenciar (Illumina)

• RNA-Seq

• Construcción de bibliotecas

  
  

  Problema: ¡gran parte del ARN es ribosomal!

  

  Dos opciones: ARNm o ARN total

  

• RNA-Seq

  
  

• Secuenciación con Illumina

  

• RNA-Seq

  
  

• Secuenciación con Illumina

• RNA-Seq

  
  

• Secuenciación con Illumina: SR vs PE

  
  
  

  

• Procesamiento primario

• Tras secuenciar, se obtienen imágenes
  
  

  

  • Son varias imágenes (120) por linea
  
  
  • Se toman por ciclo y por base
  
  
  • Se analiza intensidad para cada ciclo y se determinan secuencias de clusters ("base-calling")
  
  
  • El proceso (algoritmo) de base-calling posee cierto error (por presencia de ruido, etc.)
  
  
  • Todo esto lo hace automáticamente la plataforma, no nosotros

• RESULTADO: archivo FASTQ

  
  
• 
  

  @M00967:43:000000000-A3JHG:1:1101:18327:1699 1:N:0:188 ←   identificador
  NACGGAGGATGCGAGCGTTA ←   secuencia
  +
  #>>AABABBFFFGGGGGGGG ←   calidad
  @M00967:43:000000000-A3JHG:1:1101:14069:1827 1:N:0:188
  TACGGAGGATGCGAGCGTTA
  +
  3AA?ABBDBFFBEGGEGGGG
  @M00967:43:000000000-A3JHG:1:1101:18044:1900 1:N:0:188
  TACGGAGGATGCGAGCGTTG
  +
  BA@BBBABBFFFGGGGGGGG

• Alineamiento

  
  

Alineo lecturas a mi genoma de referencia

Cuento lecturas alineadas a cada gen

Interpretando resultados

• Profundidad de secuenciación -
  cobertura

  
  

Profundidad de secuenciación o tamaño de la biblioteca
Cantidad de lecturas totales en réplica (ej., 10 M)

• Profundidad de secuenciación -
  cobertura

  
  

Cobertura
Número promedio de lecturas que alinean en una base específica del genoma = cuántas veces una base fue leída en promedio durante el proceso de secuenciación

• Profundidad de secuenciación -
  cobertura

• Expresión diferencial

  
  

• Base teórica

  
  
  Nivel de expresión de un gen ∝ cantidad de lecturas alineadas al mismo
  
  

• Expresión diferencial

  
  

• Base teórica

  
  
  Nivel de expresión de un gen ∝ cantidad de lecturas alineadas al mismo
  
  

  Sin embargo...

  
  
  
  
  

  genes más largos tendrán más lecturas

  
  

• Expresión diferencial

• Base teórica

  
  
  Nivel de expresión de un gen ∝ cantidad de lecturas alineadas al mismo
  
  

  Sin embargo...

  
  
  
  
  

  réplicas con mayor tamaño de biblioteca tendrán más lecturas

  
  

• Expresión diferencial

  
  
Normalización


• CPM   (Counts Per Million)
  10⁶ x (lecturas gen g) / numero total de lecturas alineadas


• RPKM  (Reads Per Kilobase of gene Per Million reads)
  10 ⁹ x (lecturas gen g)/ [(longitud gen g) x (número total de lecturas alineadas)]


• FPKM   (Fragments Per Kilobase of gene Per Million reads)
  10 ⁹ x (lecturas gen g)/ [(longitud gen g) x (número total de pares de lecturas alineadas)]

• Expresión diferencial

  
  
• FC (Fold Change)



• CONTEO-NORMALIZADO_tratamiento/CONTEO-NORMALIZADO_control



• logFC (log Fold Change)



• log₂[(CONTEO-NORMALIZADO_tratamiento+1)/(CONTEO-NORMALIZADO_control+1)]


• por ej., usando RPKM

• Expresión diferencial

  
  

Diseño Experimental

• Diseño experimental

  
  
• 

• Diseño Experimental

  
  
• Fuentes de error técnico




• Efectos de batch
  errores que ocurren desde la fragmentación del ARN hasta que entra en la celda de flujo (PCR, etc.)



• Efectos de línea
  errores que ocurren desde el ingreso de las muestras a la celda, hasta la obtención de los datos del secuenciador (ej., errores en base-calling)

• Diseño Experimental

  
  
• Pregunta: ¿Cuántas celdas/líneas debo usar?




• 7 tratamientos, 3 réplicas biológicas por tratamiento, 3 celdas



• 



• Aleatorizar en cada celda
  

• Diseño Experimental

  
  
• Pregunta: ¿Cuántas celdas/líneas debo usar?




• Multiplexing
• 



• Permite controlar los efectos de batch y de línea

• Diseño Experimental

  
  
• Pregunta: ¿Cuántas celdas/líneas debo usar?



• Multiplexing (con réplicas biológicas y técnicas)
• 

• Otros usos de la secuenciación masiva

  
  
• Genómica, epigenómica



• DNA-Seq :
  WGS (Whole-Genome Sequencing), WES (Whole-Exome Sequencing)
  >Detección de variación genética (SNPs, deleciones, inserciones, variaciones estructurales), GWAS
• ChIP-Seq (Chromatin Inmuno-Precipitation):
  Análisis de interacción de proteinas con ADN
• (...lista larga de técnicas...)


• -> Distintos objetivos y formas de obtener bibliotecas, igual procedimiento de secuenciación

• ¿Qué está pasando en el año 2017?

  
  
• Single-cell RNA-Seq (scRNA-seq): análisis del genoma de células individuales



• 

  (Zeisel et al. 2015)

• Usos de scRNA-seq

  
  

(Kolodziejczyk et al. 2015)


• Identificación de subpoblaciones celulares en órganos y tejidos


• Búsqueda de marcadores para diferenciar subpoblaciones celulares


• Otros...

• ¿Qué nos depara el futuro?

  
  
• 

• Third-generation sequencing

• (en desarrollo actualmente)

• Third-generation sequencing




• Ventajas:

  • Se secuencian moléculas individuales: evita paso de PCR previo para construcción de bibliotecas y clusters
  • Genera lecturas largas (>100pb)
  
  

• Desventajas:

  • Alta tasa de error en la identificación de bases
  
  

  Tecnologías:

  • PacBio
  • MinION (secuenciador portatil)